在現(xiàn)代生物技術(shù)中，當(dāng)確定生物樣品中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和數(shù)量時，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)被廣泛使用。由于其高靈敏度，它甚至可以識別最小的抗原濃度。

ELISA的敏感性歸因于其識別單一抗原-抗體復(fù)合物之間相互作用的能力。

Elisa試劑盒在持續(xù)的變化中的醫(yī)學(xué)研究和診斷領(lǐng)域。由于其非凡的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性，這些試劑盒對于解決醫(yī)學(xué)謎題和研究新的治療方法是需要的。隨著科學(xué)好奇心和技術(shù)進步，它們的使用已經(jīng)擴展到包括從傳染病到癌癥生物標(biāo)記識別的各個領(lǐng)域。他們每天都有新的突破，幫助改善病人護理和革命性的醫(yī)學(xué)進步。

酶聯(lián)免疫試劑盒在細(xì)胞因子檢測中的應(yīng)用

這ELISA技術(shù)包括各種免疫測定，它們的程序幾乎沒有區(qū)別。幾個參數(shù)，例如被檢測的抗原、可用于特定抗原的單克隆抗體以及必要的測試靈敏度，決定了使用哪種版本的ELISA。夾心法和間接ELISA是細(xì)胞因子檢測中常用的兩種方法。

1.夾心ELISA

細(xì)胞因子夾心ELISAs是敏感酶免疫測定其可以精確地鑒定和測量可溶性趨化因子和細(xì)胞因子蛋白的量。高純度的抗細(xì)胞因子抗體(捕獲抗體)用于基本的細(xì)胞因子夾心ELISA方法。這些抗體非共價吸附在塑料微孔板上。固定的抗體用于選擇性地結(jié)合在樣品中發(fā)現(xiàn)的可溶性細(xì)胞因子蛋白，所述樣品在洗板后加入到板上。

去除未結(jié)合的物質(zhì)后，使用生物素偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體(檢測抗體)來鑒定已經(jīng)收集的細(xì)胞因子蛋白。隨后是酶標(biāo)記的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白步驟。

一；一個ELISA閱讀器可用于在加入生色底物后，在可接受的光密度(OD)下，通過分光光度法簡單地定量由結(jié)合的酶聯(lián)檢測試劑產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量。當(dāng)板閱讀器連接到計算機時，數(shù)據(jù)存儲和再分析變得更容易。

這ELISA夾心法是高精度測量分析物的方法。這種形式可以揭示分析物的特異性和靈敏度，從固定分析物的捕獲抗體開始。當(dāng)加入帶有酶標(biāo)記的檢測抗體時，三明治就像積木一樣組裝起來了。它通過識別分析物上的額外表位來完成復(fù)雜的三明治結(jié)構(gòu)。

2.間接ELISA

間接ELISA是一種二級結(jié)合抗體鑒定一級抗原特異性抗體的方法?？贵w測序協(xié)調(diào)間接Elisa中的靈敏度和信號放大。在這種結(jié)構(gòu)中，兩種抗體協(xié)同工作來擊敗分析物。具有高特異性的第一抗體尋找分析物并形成不可逆的結(jié)合。

第二抗體然后使用酶標(biāo)記來識別并將其自身附著到原始抗體上。兩種抗體協(xié)同作用，增強了信號，提高了靈敏度，即使是極微量的分析物也能突顯出來。

當(dāng)用于細(xì)胞因子檢測時，間接ELISA的靈敏度高。這主要是因為第一抗體可以附著許多與酶結(jié)合的第二抗體。此外，一種酶偶聯(lián)的二抗可以識別多種一抗。這為用戶提供了根據(jù)需要在幾個ELISA中使用相同的酶偶聯(lián)的第二抗體的選擇(獨立于被檢測的抗原)

選擇合適的ELISA試劑盒

考慮以下因素將有助于您的ELISA試劑盒發(fā)揮最佳性能:

1.抗體的特異性

這為ELISA測試選擇抗體取決于特異性和親和性標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合更精確，減少了背景信號。多克隆和單克隆可以一起使用，也可以分開使用。盡管多克隆會產(chǎn)生更高的信號，但非特異性結(jié)合也會更普遍。您還需要每次都進行廣泛的測試，因為多克隆會表現(xiàn)出更多的批次間差異。

術(shù)語“配對"描述單克隆抗體、多克隆抗體或兩種抗體的混合物，用于在實驗中檢測單一抗原。這些抗體應(yīng)該已經(jīng)通過與幾個表位結(jié)合并作為有效的“捕獲"和“檢測"對而表現(xiàn)出良好的功能。

2.靈敏度和檢測范圍

每個ELISA試劑盒都設(shè)計用于檢測不同的目標(biāo)，并具有好的功能；它們不是普遍適用的。了解您的ELISA試劑盒的靈敏度和特異性，以及每一步的精確增強，將提供準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示您目標(biāo)的測量結(jié)果。

每個包裝中將包含針對每個目標(biāo)定制的試劑和ELISA緩沖液。在測試開始時，確保您了解每組參數(shù)，如抗體類型、孵育持續(xù)時間、溫度和報告系統(tǒng)。如果你事先熟悉這一點，它會節(jié)省你大量的時間和煩惱。

3.樣本兼容性

了解特定的ELISA試劑盒是否與您的樣品組成(基質(zhì))相容(或不相容)。試劑盒的性能通常使用各種矩陣進行評估，結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)在說明書和其他輔助材料中。確保您了解ELISA試劑盒在樣本(尿液、組織培養(yǎng)、血漿、血清等)的基質(zhì)中的描述。).雖然這并不一定意味著試劑盒不起作用，但它將有助于了解您是否需要更多的驗證分析來確定它在您的興趣矩陣中的表現(xiàn)如何。

4.驗證和質(zhì)量控制

使用質(zhì)控樣本在以下位置進行一些測試生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的各種稀釋度充分利用你的裝備。當(dāng)你知道合適的稀釋度時，保存好你的樣品。在了解要使用的樣品和稀釋液后，您可以有效地安排您的樣品板。確保按照試劑盒的說明使用所有孔。如果根據(jù)給出的信息需要額外的檢測試劑，請?zhí)砑印?/span>

實驗協(xié)議

在生成有價值和有意義的數(shù)據(jù)時，以準(zhǔn)確性和可重復(fù)性為目標(biāo)。始終牢記ELISA方案，以確保一致性、最佳性能和精確結(jié)果。以下是需要考慮的實驗方案:

• 在開始實驗之前，給試劑盒試劑大約30分鐘的時間，使其達到室溫或規(guī)定的溫度。
• 此外，冷凍樣品必須全解凍，凍融循環(huán)次數(shù)應(yīng)保持在低水平，不超過三次。
• 在實驗期間和實驗之間保持一致的環(huán)境條件，如溫度和濕度。
• 確保每一件設(shè)備，如閱讀器、

  洗板機和移液器已校準(zhǔn).

• 使用足夠的抗體。
• 使用新制備的底物溶液，在使用前儲存數(shù)小時。
• 在測試過程中，始終如一地處理樣品，并遵守相同的方案。
• 在操作過程中目視檢查吸頭和孔，以確保吸取、試劑添加和提取。水平應(yīng)該是一樣的。
• 為了更好地利用您的試劑，請在ELISA檢測中混合批次。每個ELISA試劑盒被組裝成使得組件作為一個單元起作用。測試之間的大量混合可能會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。
• 試劑一旦使用，切勿放回瓶中。
• 測試后，保持托盤關(guān)閉，以防止孔變干。

成功檢測細(xì)胞因子的技巧

1.樣品制備

在開始你的主要實驗之前，用一個小樣本來確定合適的稀釋范圍。您的樣本必須符合微量滴定板測試的格式。被檢測的生物標(biāo)記物的數(shù)量總會有變化。

由于您正在尋找符合樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，請使用試劑盒說明作為指南。請注意，含有膽紅素或其他干擾因素的樣本會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。以下樣品可用于ELISA試劑盒:細(xì)胞裂解物、血清、唾液、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

2.已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)

確定濃度的滴定ELISA標(biāo)準(zhǔn)對于任何ELISA都是不可少的，因為它們使用戶能夠確定抗原濃度在測試樣本中。為了建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常要留出一系列的孔，并加入已知量的a將純化的重組蛋白逐漸加入孔中.

然后，當(dāng)這些孔與測試樣品同時處理時，用戶可以從酶標(biāo)儀獲得已知蛋白質(zhì)濃度的一組參考吸光度值，以便與測試樣品的吸光度值一起使用。

之后，您可以計算標(biāo)準(zhǔn)曲線，與測試樣品進行比較，以確定所需蛋白質(zhì)的濃度。也可以使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來驗證用戶進行稀釋的準(zhǔn)確度。

3.添加底物

孔中酶的量與ELISA底物被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品。最常見的附著在抗體上的酶是堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶。正如可以假設(shè)的那樣，可以獲得針對每種酶定制的產(chǎn)生熒光或生色產(chǎn)物的各種底物。

此外，底物具有多種靈敏度，這可能會提高檢測的總靈敏度。當(dāng)選擇合適的底物和酶偶聯(lián)抗體時，您還必須考慮在實驗結(jié)束時讀取ELISA板的設(shè)備。

4.檢測和分析

一種計算ELISA靈敏度的常規(guī)方法是選擇產(chǎn)生比平均背景信號值高至少兩到三個標(biāo)準(zhǔn)偏差的信號的*低濃度的細(xì)胞因子。

特定的細(xì)胞因子和趨化因子蛋白存在于混合的細(xì)胞因子環(huán)境中，例如刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液。因此，由于檢測抗體信號的酶介導(dǎo)的擴增，夾心ELISA可以定量這些蛋白質(zhì)的生理相關(guān)量。

如何分析ELISA數(shù)據(jù)

1.成績統(tǒng)計

在ELISA過程中，未知樣品的值通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線進行比較來確定。在樣品稀釋的情況下，稀釋系數(shù)需要乘以從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的濃度值。ELISA樣品應(yīng)總是一式三份或兩份，以提供具有足夠數(shù)據(jù)的結(jié)果進行統(tǒng)計驗證。

對于每個標(biāo)準(zhǔn)品、對照品和樣品，計算兩次或三次測量值的平均值，并減去平均零標(biāo)準(zhǔn)光密度(OD)。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV)不應(yīng)超過20%。

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線

使用計算機軟件繪制平均吸光度對蛋白質(zhì)濃度的曲線，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保您遵循ELISA試驗協(xié)議建議的數(shù)據(jù)簡化技術(shù)。

已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白質(zhì)溶液被連續(xù)稀釋以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線，該標(biāo)準(zhǔn)曲線被添加到夾心ELISA測試中。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線也稱為“校準(zhǔn)曲線"它們通常是通過將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白濃度(通常表示為ng或pg細(xì)胞因子/ml)對相應(yīng)的重復(fù)平均OD值作圖而得到的。

可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出可疑的含細(xì)胞因子樣品的濃度。ELISA計算機軟件程序有助于這一操作。為了確保OD位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域內(nèi)，請確保對未知樣品進行一系列稀釋。研究人員可以選擇對他們的數(shù)據(jù)進行各種曲線擬合分析，如線性對數(shù)、對數(shù)對數(shù)或四參數(shù)轉(zhuǎn)換，這取決于所用的ELISA試劑的種類。

如果軟件不可用，可通過在線性標(biāo)度上繪制濃度記錄與OD記錄的圖表，使ELISA數(shù)據(jù)分析線性化?；貧w分析可用于找到最佳擬合線。該過程將產(chǎn)生足夠的但不太精確的數(shù)據(jù)擬合。

3.計算變異系數(shù)

變異系數(shù)(CV)描述了標(biāo)準(zhǔn)偏差與平均值的比率，通常用百分比表示。CV計算至關(guān)重要，因為它可能會揭示ELISA數(shù)據(jù)中的任何差異或錯誤。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)(CV)不應(yīng)超過20%。更高的簡歷意味著更多的不準(zhǔn)確和潛在的錯誤。

ELISA常見問題的故障排除

每種ELISA都有一定的缺點。首先，測試樣本中存在多少目標(biāo)蛋白質(zhì)的問題。如果數(shù)量過高或過低，酶標(biāo)儀產(chǎn)生的吸光度讀數(shù)可能會分別超出或低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的極限。因此，估計測試樣品中蛋白質(zhì)的精確數(shù)量將是一個挑戰(zhàn)。

如果讀數(shù)非常高，在將測試樣品放入板的孔中之前稀釋它。根據(jù)稀釋系數(shù)，必須修改最終數(shù)字。DIY試劑盒有時需要仔細(xì)優(yōu)化抗體濃度，以獲得良好的信噪比。

結(jié)果

各種ELISA技術(shù)已被改進，以定量分析不同實驗標(biāo)本中的抗原水平。然而，它們背后的基本思想都是一樣的。在選擇是采用間接ELISA還是夾心ELISA時，待檢樣品的復(fù)雜性和抗原特異性抗體的可用性是關(guān)鍵考慮因素細(xì)胞因子檢測.

當(dāng)確定免疫反應(yīng)的結(jié)果時，例如計算樣品中抗體的含量，可以使用間接ELISA。當(dāng)檢查復(fù)雜樣品時，其中分析物或靶抗原存在于混合樣品中，如組織裂解物或培養(yǎng)上清液，夾心ELISA是最合適的方法。